Slik tester for nukleinsyrer

Testing for nukleinsyrer utføres i medisinsk diagnostikk for å detektere patogener, slik som virus eller bakterier. Disse testene er mye raskere og derfor muliggjøre en lege for å starte behandling for en pasient som vanligvis ville ha måttet vente på bekreftelse av infeksjon med mer lang og kjedelig antistoff-baserte analyser. Prosessen er også kjent som en nukleinsyreampliifseringsmetoder test, og omfatter en metode som er kjent som "revers-transkriptase forsterkning" av polymerasekjedereaksjon. Siden dette er et høyt spesialisert vitenskapelig prosedyre, avansert kunnskap og kompetanse i molekylærbiologi teknikker og teori er nødvendig. Du trenger:
PCR rør
PCR cycler
Pipetter og filter tips
Hansker
Cells
Trizol eller andre RNA Ekstraksjonsreagens
PCR buffer
Taq polymerase
RT-PCR primere ved 1 mg /ml konsentrasjon
RNase-fritt vann
dNTPs
MgCl2
Tilfeldige primere på 1,8 mg /ml konsentrasjon
SuperScript II revers transkriptase

Vis mer Instruksjoner
Bearbeiding og utarbeidelse av RNA
en

Harvest-celler med en RNA Ekstraksjonsreagens, for eksempel Trizol. 1 ml, er tilstrekkelig til å samle celler fra én brønn av en seks-brønners vevkulturplate. Cellene ble grundig pipettert opp og ned for å homogenisere dem og deretter utføre ekstraksjonen prosedyre som beskrevet i Trizol dataarket. Kort, ekstraher med kloroform, deretter sentrifugeres for å separere fasene av DNA, protein og RNA. Gjenopprette bare det fargeløse RNA fase og bunnfall som med isopropanol. Etter inkubering sentrifuger at og rydde opp den resulterende pellet med flere vaskinger etanol. Deretter resuspender pelleten i RNase-fritt vann.
2

For revers transkripsjon, denature nøyaktig 5 mikrogram RNA på 65 grader Celsius i en 10 mikroliter (ul) volumet av RNase-fritt vann, deretter raskt sted på is. For hver reaksjon, kombinere 10 pl av RNA, 3 ul av 10X PCR-reaksjonsbuffer, 2,5 ul av 10 millimolar dNTP, 6 l av 25 millimolar magnesiumklorid, 1 ul av tilfeldige primere på 1,8 milligram per milliliter konsentrasjon, og 0,5 ul av SuperScript II revers transkriptase enzymet. Fyll opp hver reaksjon med 17 ul av RNase-fritt vann. Inkuber rørene ved romtemperatur i ti minutter og deretter ved 42 ° C i en time for å produsere cDNA, deretter denatureres ved 95 grader Celsius og raskt is for å stoppe reaksjonen.
3

For en polymerase kjedereaksjon, igjen sette opp en reaksjonsblanding i 0,5 ml rør ved å kombinere 6 pl av cDNA gjort i omvendt transkripsjon reaksjon, 1,5 ul av 10X PCR-reaksjonsbuffer, 0,2 mikroliter av Taq-polymerase, 0,5 mikroliter av revers primer og også av forward primer, deretter topp opp hvert rør med 10,3 ul av RNase-fritt vann. Å kjøre reaksjoner, sette opp en termosykler (dvs. en maskin som utfører polymerase kjedereaksjoner) for 30 sykluser som følger: 95 grader i 0,5 minutt å denature, etterfulgt av 60 grader Celsius i 45 sekunder for å anneal, og til slutt 72 grader Celsius for 1 minutter å forlenge syntetisert karakterutskriften.