Celle-baserte ELISA -protokollen

ELISA , eller enzym -linked immunosorbent assay , blir brukt som et diagnostisk verktøy i medisin og i biologisk forskning å kvantifisere mengden av et bestemt protein . ELISA anvender antistoffer for å påvise proteinet av interesse , og et reagens som gir en farge . Mengden av farge relateres til mengden av protein. Cellekultur

Cells bør plasseres i brønnene til en 96- brønners plate med 100 micro - liter vekstmedier og cellene igjen å bosette over natten. Hvis du studerer cellenes reaksjon på en faktor , bør cellene være serum -sultet i 24 timer og deretter stimulert med faktor under studien .
Fiksering og Primær antistoff

Etter fjerning av mediet , blir cellene behandlet med et bindemiddel slik som 3 prosent formaldehyd, eller metanol. Den cellemembran må permeabilized for å tillate antistoffet å trenge inn i cellen. Permeabilization kan oppnås ved bruk av 0.1 prosent Triton, hvis metanol ikke tidligere har blitt benyttet. Ikke-spesifikk binding kan forhindres ved bruk av 10 prosent kalvefosterserum fortynnet i fosfat -bufret saltvann . Etter fjerning av blokken , kan det primære antistoffet brukes og inkubert i en time.
Sekundært antistoff og Stain

Fjern den primære antistoff, og vask tre ganger. Legg et sekundært antistoff knyttet til en gjenkjennings- middel, så som pepperrot peroksydase . Inkuber i en time . Wash Legg chemiluminescent substrat løsning. Utvikle og skanne plate for fargeintensiteten .