Hvordan måle NADH

NAD og NADH er begge pyridine nukleotider som er involvert i stoffskiftet. NADH og NAD er ko-enzymer funnet i mitokondriene, kraftstasjoner av cellen. Både NAD og NADH er involvert i cellulære reaksjoner som respirasjon og fotosyntese hvor energi og hydrogen blir generert. NAD og NADH-drivstoff biokjemiske reaksjoner som krever en rekke enzymer for å produsere ATP, den viktigste energikilden i cellene. Du trenger:
celler eller vev som studeres
NADH analysen kit
Fosfat-saltløsning
Dry Ice
Oppvarming blokk
96 brønners plate
Sentrifuger
Merket rør
Plateavleser
Vortex
kjent konsentrasjon av NADH
Vis mer Instruksjoner
analysen
en

Vask cellene eller vevet under studien med kaldt fosfat -bufret saltvann, PBS. Ekstraher celler eller oppbrytning vev i utvinning buffer ved å plassere blandingen på tørr is i 20 minutter og deretter ved romtemperatur i 10 minutter. Gjenta.
2

Vortex i 10 sekunder. Spinn i en sentrifuge i 5 minutter til pellet celle eller vev rusk. Fjern supernatanten, væskefase, og plasser væske i et rent rør.
3

Filter supernatanten gjennom et spesialisert filter for å fjerne enzymer som vil sammenbrudd NADH.
4

Fjern 200 mikro liter, legg i et rent rør og varme på 60 grader Celsius i en oppvarming blokk i 30 minutter til denature NAD. Avkjøl og sentrifuger og fjerne væskefase. Overfør 50 mikro liter i en 96-brønns plate, hver prøve må være i duplikat eller triplikat. Å bestemme total NAD, NADt, ikke varme.
5

Utarbeide og legge sykling mix til 96-brønners plate. Bland og inkuberes i 5 minutter. Legg 10 mikro liter utvikler og la å ruge ved romtemperatur i opptil fire timer. Legg stop-løsning. Les fargeendring på en plate-leser eller fluorimeter avhengig kit.
Standard Curve og Beregning
6

Utarbeide en standard kurve ved å ta en kjent konsentrasjon av NADH og fortynne det i utvinning buffer. Fortynne inn i ulike konsentrasjoner, noe som sikrer slutten volumet forblir den samme som stikkprøvene. Plate på den samme 96-brønners plate som testprøver. Les optisk tetthet.
7

Tegn standard kurve grafen med konsentrasjon på X-aksen og optisk tetthet på Y-aksen. Ta et gjennomsnitt av hver test prøve og lese konsentrasjonen fra standard kurve grafen.
8

Beregn NAD /NADH ratio ved å trekke total NAD, NADt, fra NADH og deretter dele på NADH.