Nedfrysing Prosedyrer

laksegener prosedyrer er de som tillater cellene å lagres på ubestemt tid ved å bruke ekstremt kalde temperaturer for å suspendere metabolske aktiviteter. Det er to hovedtyper av nedfrysing prosedyrer: likevekt (vanlig treg frysing) og ikke-likevekt eller ultra-rask frysing (vitrifisering). Begrepet vitrifisering kommer fra det latinske "glasslegemet" eller glassaktig. Begge prosedyrer bruke cryoprotectants med frostvæske-type eiendommer for å hindre cellular skade under frysing. Når cellene er frosset eller forglasset, kan de oppbevares i ubegrenset tid ved å dyppe dem i flytende nitrogen, et ekstremt kaldt fluid med en temperatur på -196 C (-321 F). For å gjenopprette metabolsk aktivitet i cellen etter tining må giftige cryoprotectants bli fjernet fra cellen og den normale vann-balansen gjenopprettes etter hvert som cellen blir returnert til en normal funksjon temperatur. Oversikt

Oversikt

laksegener prosedyrer er de som tillater cellene å lagres på ubestemt tid ved å bruke ekstremt kalde temperaturer for å suspendere metabolske aktiviteter. Det er to hovedtyper av nedfrysing prosedyrer: likevekt (vanlig treg frysing) og ikke-likevekt eller ultra-rask frysing (vitrifisering). Begrepet vitrifisering kommer fra det latinske "glasslegemet" eller glassaktig. Begge prosedyrer bruke cryoprotectants med frostvæske-type eiendommer for å hindre cellular skade under frysing. Når cellene er frosset eller forglasset, kan de oppbevares i ubegrenset tid ved å dyppe dem i flytende nitrogen, et ekstremt kaldt fluid med en temperatur på -196 C (-321 F). For å gjenopprette metabolsk aktivitet i cellen ved tining, må giftige cryoprotectants fjernes fra cellen og normal vannbalansen gradvis restaurert som cellen er tilbake på normalt fungerende temperatur.
Cell- spesifikke faktorer

Prosedyren brukes til å fryse ned celler eller vev avhenger av en rekke faktorer, inkludert størrelsen på cellen, mengden av mobilnettet væske (cytoplasma) og kompleksiteten av cellen (enkelt celle eller vev). Celler med en stor mengde av cytoplasma som egg er vanskeligere å cryopreservere enn celler med cytoplasma bare rester, som sædceller. Kryopreservering av vev ovariene er mer utfordrende fordi minst tre forskjellige celletyper av varierende størrelse er til stede i ovariene vev, hver med forskjellige optimale frysing behov. Treg-fryseprotokollene som er blitt anvendt med suksess med forskjellige typer celler. Vitrifisering er for tiden mest effektive med encellede frysing og mindre effektiv med vev, men forskning pågår for å optimalisere vitrifisering av vev.
Rolle cryoprotectants

cytoplasma en celle inneholder vann, som blir til iskrystaller på frysepunktet. Når is dannes inne i en celle, er cellen opprevet og dør. Derfor må fluidet i cellen som skal fjernes før det når det er kuldegrader å unngå celleskader. Forskjellige typer av frostvæske (kryobeskyttende) fluider kan brukes til å dehydratisere cellen før frysing, inkludert glycerol, propandiol, dimetyl sulfoxde (DMSO), etanol og sukker slik som sukrose og trehalose. Den optimale hastighet for kjøling (og tining) avhenger av typen av kryobeskyttende brukt og på karakteristisk for cellen eller vevet for å være (eller som var) frosset. Cryoprotectants er giftig for metabolizing cellene slik celle eksponeringer til cryoprotectants på varmere metabolske temperaturer må minimeres eller unngås. Ved tining og oppvarming cellene, må cryoprotectants bli fullstendig fjernet fra cellen før metabolsk aktivitet er gjenopprettet.
Equilibrium Versus Non-Equilibrium Nedfrysing Prosedyre

Satsen for frysing avhenger av om frysing protokollen er likevekt-eller ikke-equilbrium-basert. For likevekt typen prosedyrer, er den optimale frysehastighet oppnås når det finnes en balanse mellom hastigheten som cellen blir dehydrert med vann og den hastigheten som vannet utenfor cellen blir transformert til is-stadiet. Disse likevekt eller sakte fryse protokoller vanligvis ta flere timer å fullføre, og en datamaskin brukes til å kjøre en programmerbar rente fryser for å sikre at frysing priser er nøyaktig slik de skal. Det er vanligvis en "hold" skritt i protokollen nær start å tillate manuell oppretting av start iskrystaller eller "seeding" i væsken utenfor cellene.

Vitrifisering, en helt annen tilnærming til frysepunktet som ikke er avhengig av ramper og oppnå en likevekt mellom dehydrering og is krystalldannelse brukes. Forglassing er så ultra-hurtig at det ikke er tilstrekkelig tid for dannelse av is og den cellulære fluidet omdannes direkte i et glasslegeme eller glass fase, uten skade på cellen. Programmerbare rente frysere er ikke nødvendig fordi cellen er direkte kastet ut i ekstremt kaldt flytende nitrogen, oppnå en øyeblikkelig glassaktig tilstand.
Slow-Freeze Prosedyre

Det første trinnet av at det langsomt fryse prosedyre er å eksponere cellen for å kryobeskytter i en gradvis trinnvis måte for å tillate langsomt ekvilibrering av cellen med det kryobeskyttende under frigjøring av vann. Når cellene er blitt fjernet av de fleste cellulære vann, cellene i den kryobeskyttende fluid plassert i en beholder med en form, slik som et plastrør, en glassampulle eller en plast vial.The væskevolum som omgir cellene for langsom frysing er vanligvis mindre enn en teskje, og kan bare være noen få dråper. Den pre-merket beholder er fylt, forseglet og satt i en programmerbar fryser, som langsomt synker temperaturen av beholderen over en periode på minutter eller timer til meget lave temperaturer. Etter noen minutter med kjøling, må starteren iskrystaller dannes i beholderen ved "seeding" beholderen. Poding blir utført ved hjelp av et verktøy (for eksempel tang) som har blitt pre-kjølt i flytende nitrogen for å berøre beholderen og føre isen til krystalldannelse. Dette starter krystall vil initiere kontrollert iskrystall formasjon på ett sted, trygt vekk fra cellene. Etter såing er fullført, kan resten av de avkjølende ramper fortsette. Når beholderen når temperaturer mellom -30 og -85 C, kan beholderen som holder cellene bli kastet direkte inn i flytende nitrogen for å fullføre kjøling til -196 C.
Forglassing

Ultra-rask ikke-likevekt chilling prosedyrer som for eksempel vitrifisering bruke høyere konsentrasjoner av cryoprotectants kombinert med en nesten momentant frysehastighet oppnås ved stuper celler direkte i flytende nitrogen. Forglassing omgår is-krystalldannelse fase og beveger vannet direkte inn i en glass-aktig fase. Vitrifisering oppnår samme endepunkt så sakte frysing, men med en hastighet på -3000C/min, sammenlignet med 10C/min eller mer. For forglassing, blir cellene vanligvis plassert på tuppen av en halm og overskudd av kryobeskyttende middel er fjernet, slik at bare nok, slik at celle klynger seg til beholderen ved overflatespenning, før stuper i flytende nitrogen. Fordi frysing er så hurtig, er varigheten av eksponering for cryoprotectants mye mindre og mye høyere konsentrasjoner av cryoprotectants kan tolereres av cellen. Oppvarming av cellen for å returnere den til normal metabolsk funksjon må også være utrolig rask. Håndtering av vitrified prøvene er mye mer krevende enn slow-frosne prøvene fordi selv en kort eksponering til en temperatur over at av flytende nitrogen kan starte en uplanlagt oppvarmingen og refreezing, som er skadelig for cellen.