Å gjøre Line Up DNA for analyse?

Agarosegelelektroforese er den vanligste metoden for visuell analyse DNA-fragment, som tillater teknikere for å skjelne visuelt DNA-fragmenter basert på størrelse. Den agarosegel opprettholder et magnetisk felt, og, ettersom DNA har en negativ ladning, beveger den mot den positive ende av det magnetiske felt. Mindre DNA-fragmenter beveger seg raskere gjennom gel og større fragmenter bevege seg saktere. DNA-fragmenter ble fluorescensmerket farget med en interkalerende middel som er kjent som etidiumbromid. Dette gjør det mulig for sammenligning av flere elektroforert DNA-prøver på en gel. Du trenger
Agarose gel, 0,7 prosent til 2 prosent
Tris-borat-EDTA (TBA), tris-acetat-EDTA (TAE), sodium lithium acetat (LA), borsyre (SB) buffer
Etidiumbromid
Gel loading dye
Gel skuffen
Elektroforese kammer
Hansker
beskyttende øye slitasje
Pipette
elektroforese kam
Vis flere instruksjoner
Forbereder en 0,7 prosent agarosegel
en

Vei opp 0,7 g agarose pulver og deretter plassere inn i en stor (250 ml) erlenmeyerkolbe.
2

Legg 100ml av en 1X (vanlig styrke) buffer (TAE, TBE, SB eller LB buffer) til erlenmeyerkolbe inneholder agarose pulver.
3

Mikrobølgeovn eller varme ved hjelp av en gassbrenner for omtrent ett minutt før løsningen blir klar og agarose er oppløst.
4

Fjern kolben fra varmekilden og la den avkjøles til 55-60 grader Celsius.
5

Legg til en mL (mikroliter) av etidiumbromid til den avkjølte agarose løsning ved hjelp av en passe stor pipette, vanligvis 1 ml. Swirl løsningen for å blande.
6

Hell gel sakte inn i gel skuffen, slik det er ingen bobledannelse i løpet av denne prosessen. Hvis det ikke er levert vel dammer med gel skuffen, bruk maskeringstape for å danne dem.
7

inn en elektroforese kam forsiktig inn i gel, noe som sikrer en fast stilling og i riktig retning. Elektroforese kammer kan variere sterkt på antall tenner de har. La gelen satt i ca 25 minutter
8

Senk gel i samme buffer brukes til å forberede agaorse løsning -. I dette tilfellet, en 1X buffer. Senk gel i opp til 5 ml buffer.
Forberedelse og lasting av DNA inn i Agarose Gel for analyse
9

Transfer 5 til 10 ul prøven (e) fra sine Reaksjonsrørene til ferske rør. I tilfelle du ønsker å bruke hele reaksjonsblandingen, er en frisk tube ikke nødvendig.
10

Legg 0.2X lasting buffer til hver av dine friske prøverør som inneholder DNA-prøve for lasting.

11

Fjern elektroforese kammen sakte, slik at du ikke bryter gel eller lage noe plass mellom bunnen av gel og gel skuffen.
12

Legg fem til 12 pl av en egnet DNA-markør til den første brønnen opprettes av elektroforese kam. Hvorvidt en DNA-markør er hensiktsmessig avhenger av størrelsen på fragmentene du forventer fra prøven din.
13

Load fem til 10 mL av prøvene i de resterende brønnene og tilsett samme Mengden av samme DNA-markør til finalen også.
14

plassere elektrodene inn i elektroforese kammeret ved å koble ledningene i de riktige kontaktene inn i kammeret og sett elektroden til 50-150 V.

15

La gelen til å kjøre for én til fire timer.
Analyse av resultater
16

Fjern gel fra gelen kammer og plassere den enten i en UV rom for visuell identifisering, eller legge det i en maskin som er i stand til å ta et bilde av gelen.
17

Mål markører avstand på migrasjon i sine brønner.

18

Plot avstandene mot størrelsen på band på semilog millimeterpapir og tegne en best mulig passform linjen.
19

beregne avstander på dine ukjente band.

20

Beregn størrelsen på dine ukjente band ved å tegne en linje opp fra distanse etter dine ukjente band som oppfyller linje med best mulig passform.
21

Tegn en linje fra dette knutepunktet over til størrelsen aksen.