Cell Surface biotinylering protokoll

biotinylering bruker muligheten av løselig vitamin biotin bindes til proteiner. Biotin binder seg til protein strepavidin og er derfor anvendelige i cellebiologi å visualisere-proteiner. Biotinylering tillater sikker merking av proteiner i forhold til teknikker som radioaktivitet og ikke påvirker cellens normale funksjon. Den tillater forskere for å studere-proteiner slik som reseptorer, og som muliggjør en bedre forståelse av sykdommer og sykdomsprosesser. Merking Suspendert Cells

Vask cellene i iskaldt fosfat saltløsning (PBS) for å fjerne forurensninger. Buffere som inneholder tris og glycin vil konkurrere med biotinylering, og bør unngås. For å unngå biotinylating interne proteiner, kan merkingen bli utført ved 4 grader Celsius eller i nærvær av azid. Resuspender celler i PBS og løselig biotin, sulfo-NHS-LC-biotin.
Merking Adhererende Cells

Vask cellene i PBS og inkuberes med et produkt som sulfo -NHS-LC-biotin. Cellene blir deretter skrapt inn i en tallerken og lysert i en buffer som inneholder vaskemiddel Triton-X 100 og forberedt for visualisering.
Forbereder merkede celler

Etter inkubering ble cellene sentrifugert til en pellet og vasket i PBS. Cellene blir resuspendert i PBS og renset med IgG-Sepharose-gelen. Den bundne protein er fortynnet i lasting buffer og oppvarmet til 100 grader Celsius.
Visualisering Cells

Utvannet proteiner kan visualiseres ved hjelp natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese (SDS- PAGE) etterfulgt av blotting med protein og enzym-blanding, streptavidin-pepperrot peroksyd. Blotter er visualisert med en kjemisk reaksjon --- chemiluminescence --- som avgir lys. Spesifisitet av biotinylering kan bekreftes med antistoffer for protein under studien.