Hvordan lage en Restriction Kart

I de tidlige dagene av molekylærbiologi, forskere brukte begrensning kartlegging for å forstå de genene de studerte. I moderne forskningslaboratorier, er begrensning kartlegging i stor grad foreldet fordi sekvensering har blitt mer allment tilgjengelig og mer økonomisk enn tidligere. Det finnes imidlertid tilfeller hvor et restriksjonskart som kan være tilstrekkelig for en forsker for å utføre sine undersøkelser. Den generelle metode til restriksjonskartlegging involverer bruk av fordøyelsesenzymer for å bryte ned en fysisk prøve av DNA. Når du måle produkter av denne fordøyelsen, kan du "montere" bitene og utlede den opprinnelige sekvensen av DNA. Du trenger
Restriksjonsenzymer
Sample DNA
Bufferoppløsning
Is og varmt vannbad
Gel elektroforese utstyr
Vis flere instruksjoner
DNA Fordøyelse

en

Legg en begrensning enzym til DNA-prøve. Bruk EcoR1, et vanlig enzym, for eksempel.
2

Legg denne blandingen til en buffer løsning, som i hovedsak er et sted for reaksjonen til å skje.
3

Hev temperaturen i reaksjonen, som angitt i New England BioLabs håndboken. Hver restriksjonsenzym har en spesifikk reaksjonstemperatur ved hvilken den fungerer best. I tillegg har hver enzym en spesifikk nukleotidsekvens som den er utformet for å målrette. EcoRI vil skanne og kutte DNA ved Nukleotidsekvensen CAATTC. Denne nøyaktige rekkefølgen av nukleotider må foreligge for enzymet til å binde og kutte DNA. Frem til dette punkt, bør alle materialer holdes på is for å forhindre uønsket aktivitet.
4

Etter tillate reaksjonen å skje som angitt i bruksanvisningen, kjøres blandingen i en gelelektroforese maskin for å separere DNA fragmenter basert på størrelse. De minste fragmentene vil flytte lengst over gel.
5

Mål avstanden reiste med hvert DNA-fragment. Disse fem trinnene bør gjentas med flere forskjellige enzymer separat.
Constructing restriksjonskartet
6

Ved hjelp av data innhentet fra gelen, samle all den informasjonen du har funnet ved hjelp av ulike restriksjonsenzymer.
7

Utled rekkefølgen på restriksjonsseter ved å sammenligne de ulike fragment lengder produsert av hvert enzym. For eksempel, hvis enzym nr. 1 produsert to fragmenter av lik lengde og enzym # 2 produsert tre fragmenter av lik lengde, kan du konkludere med at enzymet # 1 kutt halvveis gjennom DNA og enzymet # 2 kutter DNA i tredjedeler.

8

hjelp konklusjonene i trinn 2, montere rekkefølgen på restriksjonsseter for DNA.