Molecular Cloning Protocols

molekylærkloningen protokoller omfatter prosedyrene som benyttes for å definere, isolere og reprodusere en DNA-sekvens. Tradisjonell begrensning og ligation kloning protokoller initiere DNA fragmentering med begrensede endonukleaser (enzymer som kutter DNA-strengene på restriksjonsseter), DNA fragment ligation (reparasjon av diskontinuiteter i DNA-molekyler), transfeksjon (innføring av nukleinsyre i en celle kropp) og valg (det valg av individuelle genomer for replikering). Isolation

protokoller for isolering av et DNA fragment, det første trinnet i molekylær kloning, ofte innlemme en polymerase chain reaction (PMR), som bruker sykluser med varme og kjøling til å forsterke biter av DNA. For å nå målet sekvens størrelse, andre protokoller inkluderer DNA lydbehandling, reaksjon enzymet fordøyelsen og bruk av kjemisk syntetiserte oligonukleotidene. Disse protokollene variere avhengig av omfanget og mengden av isolert DNA trengs.
Ligation

Protokoller for ligation innebære å bruke et enzym, DNA ligase, til å bli DNA-molekyler sammen med en kovalent binding. Protokollen tilsier kombinere DNA-fragmenter, kloning vektor, en ligation buffer, DNA ligase og sterilisert vann i en mikrosentrifugerør og ruger over natten ved 4 grader Celsius.
Transfection

Protokoller for transfeksjon, eller infusjonen DNA i en celle ved hjelp av en ikke-virale midler, ofte involverer injisere DNA direkte inn i cellen cytoplasma. Andre metoder inkluderer bruk av kjemiske reagenser, slik som kalsiumfosfat og lipider, for å levere den transfeksjon kompleks gjennom cellemembranen. Denne metoden tester effekten av genmodifisering på funksjon av spesifikke gener.
Selection

Selection, eller screening, protokoller bestemme hvilke celler som vellykket avholdt DNA innskuddet og indikere som cellene trenger isolasjon. En sentrifuge høster celler som inneholder det transfekterte DNA, som deretter blir inkubert i et lysozym (et naturlig forekommende enzym) buffer og behandlet med et alkalisk vaskemiddel, noe som gir proteiner og membraner oppløselighet. Ved hjelp av acetat å fremskynde proteiner, en sentrifuge og cheesecloth filter DNA-holdige supernatanten (den løselig væske gjenværende fra en sentrifugert compound). Supernatanten ble utfelt med polyetylenglykol, sentrifugert, og suspendert i en cesium-klorid og etidiumbromid-buffer. De etidiumbromid flekker av DNA etter tetthet, og ved hjelp av en dyp-UV-lys, blir det nedre bånd-DNA ekstrahert med en fem-cc sprøyte. En likevekt ionebyttekolonne skiller DNA fra etidiumbromid og cesium klorid, og den endelige DNA pellet er suspendert i en buffer løsning og oppdaget på agarosegelelektroforese.