Hvordan bruke GSH nivåer i Oppdager ROS

Glutathione, eller GSH, er en ikke-essensiell tripeptide laget av cystein, glutamat og glysin. Det er en kraftig antioksidant som beskytter celler og organer i kroppen din fra de skadelige effektene av ROS, eller reaktive oksygen arter, som er dannet fra molekylært oksygen som følge av ulike metabolske prosesser i kroppen. Antioksidanter, slik som glutation, nøytralisere den ROS og hindre dem fra å kommunisere med og skade på DNA og protein i cellene. Forholdet mellom oksidert og redusert form av GSH i kroppen din er beskrivende for ROS-relatert oksidativt stress i kroppen din. Du trenger
sprøyte
Butterfly nål
Sentrifuger
Sodium heparin
Fryser
Sulfosalicylic syre
GSH Reaction Agent
Microplate
Lyskilde
GSH standard løsning
Vis flere instruksjoner
en

Draw ca 2 ml blod ved venepunksjon til anticubetal vene med en 23-gauge butterfly nål festet til en 5 ml sprøyte. Legg prøven å teste rør som inneholder natrium heparin og forsiktig Snu røret for å blande.
2

samle de røde blodceller ved sentrifugering prøven ved 2500 omdreininger per minutt i fem minutter. Fryse og tine prøven tre ganger for å bryte cellene. Sentrifuger cellelysat løsningen i 10 minutter ved 12.000 rpm og 4 grader, og samle supernatanten.
3

Fjern proteinet fra prøven ved å tilsette 5 prosent sulfosalicylic syre og sentrifugering av prøven ved 12.000 opm i fem minutter ved 4 grader. Oppbevar deproteinated supernatanten ved -112 grader.
4

Bland en tiol deteksjon agent, GSH reduktase, nikotinamidadenindinukleotid fosfat og analysebuffer i proporsjonene angitt av kit produsenten for å gjøre GSH reaksjonsblandingen. Mengden av hver kjemiske avhenger av antall tester du har tenkt å utføre. Fortynn GSH reaksjonsblandingen i 5 prosent sulfosalicylic syre for å få konsentrasjoner på 16, 32, 63, 125, 250 og 500 mikroliter.
5

til 1 til 10 mikroliter av den deproteinated blodprøven i brønnene av en mikroplaten. Legg seriefortynnet GSH standard løsning, som er tilgjengelig i testing kit, til hver brønn for å bringe det totale volumet av hver brønn til 10 mikroliter.
6

til 90 mikroliter av GSH reaksjonsblanding som du har gjort i trinn 4 til hver brønn i mikroplaten. Bland reagens ved å riste plate i 30 sekunder.
7

Mål absorbansen umiddelbart ved å plassere plate under lys med bølgelengder av 405 og 415 nanometer. Inkuber platen i 30 minutter. Ta avlesninger etter hvert femte minutt under inkubasjon.
8

Dilute 6 millimolar av prosessert prøven med 5 prosent sulfosalicylic syre og trifluromethane sulfonate løsning. Dette vil fjerne alt det reduserte GSH fra oppløsningen. Legg 1 til 10 micoliters av denne løsningen til brønnene av microplate og gjenta trinn 5, 6 og 7. Dette vil bidra til å estimere mengden av oksidert GSH i prøven.
9

Plot henholdsvis absorbansen og sample konsentrasjoner på en graf for å oppnå den GSH-kurven for både redusert og oksidert glutation. Beregn forholdet mellom begge former for GSH. Økte nivåer oksidative GSH nivåer indikerer oksidativt stress og ROS.