Hvordan lage antistoffer Fortynninger for IHC

Immunohistokjemi (IHC) er spesialist teknikk som brukes av forskere til å visualisere celler i vev som har blitt plassert på et lysbilde og farget med en passende antistoff som gjenkjenner et protein som er unik for cellen eller vev under etterforskning. Antistoff fortynninger (titrering), må utføres ved hjelp av eksperimentelle forhold som er angitt i brukerens egen protokoll, ikke at av antistoff produsenten, siden de to kan ikke være identiske. Ting du trenger
Cells å farge
Antistoff
Fortynningsbuffer ("fortynner")
Pipetter og tips
mikrosentrifugerør
Aluminium folie
Lab markører og tube etiketter
Ice
lys beskyttet lysbilde boks
Vis flere instruksjoner
en

sjekke og klargjøre antistoffet. Kontroller at antistoffet er tatt opp i riktig vert, og reagerer med den nøyaktige versjon av proteinet (kjent som isoform, eller spleisevariant) som skal testes. Ved hjelp av en pipette, forsiktig ta en 10 mikroliter del av dette og etiketten som "personlig lager".
P Hvis bare svært små mengder antistoff er tilgjengelig, hopper du over dette trinnet.

Holde en personlig lager av antistoff er rutinemessig praksis i alle laboratorier som det forhindrer kryssforurensning av den opprinnelige lager. Tilsett dette til en lys-beskyttet microfuge tube, eller en normal microfuge rør som er innpakket i aluminiumsfolie for å beskytte mot direkte lys.

Hold dette røret på is, helst i en Esky med en lufttett lokk, nytt for å minimalisere lys, noe som kan ødelegge antistoffet. Lag et notat av den opprinnelige bestanden er konsentrasjon (f.eks 100 enheter per milliliter, en milligram per mikroliter og så videre) på røret, inkludert navnet på antistoff og hva som eventuelt buffer det fortynnes i (f.eks serum, saltvann, eller vann etc).
2

Forbered fortynning buffer, også kjent som antistoff fortynning. Kontroller at dette er forenlig med antistoff og immunohistochemistry prosedyre som brukes, for eksempel, bør det ikke skjule fluorescens eller forhindre påfølgende sekundært antistoff merking. Gjør en standard immuno-fortynning (også den blokkerende buffer) ved å blande 1X fosfatbufret saltvann med 1% Triton-X100, 10% føtalt kalveserum og 0,2% natriumazid.
3

titrere antistoff. Med en gitt konsentrasjon av antistoff i den personlige lager (uttrykt som konsentrasjon enheter, såsom mikrogram mikroliter), bestemme volumet av antistoff nødvendig for å oppnå 10 mikrogram antistoff.

Sett opp en fortynningsserie ved å pipettere en mengde tilsvarer 2 mikrogram antistoff (f.eks X mikroliter), i 100 mikroliter fortynner og bland godt med pipettering opp og ned. Med dette som fortynning, ta samme X mikroliter og legge det til en påfølgende 100 mikroliter fortynningsmiddel. Gjenta dette inntil 8-10 fortynninger (eller en serie) fremstilles.

Det siste røret vil derfor ha den laveste konsentrasjon og være "mette"-konsentrasjon som vil gi den høyeste grad av signalet i løpet av eksperimentet . Imidlertid vil den ideelle konsentrasjonen være litt mer konsentrert enn dette, slik at ikke for mye signal er produsert, noe som kan føre til bakgrunnen feil.

Etikett rørene riktig med de nye utvannet konsentrasjoner.