Intracellulær Farging Protokoll for flowcytometrisystemer

Flowcytometri er et verktøy som er nyttig i studiet av proteiner. Det benytter emisjon av lys eller fluorescens fra de proteinene i cellen . Antistoffer eller prober merket med fluorescens blir brukt til å studere spesifikke proteiner . Strømningscytometri er brukt for å diagnostisere en rekke sykdommer, inkludert kreft , men er også nyttige i medisinsk forskning . Fikse Cells

Cells skal festes for å opprettholde stabiliteten av de intracellulære proteiner. En rekke fiksativ kan brukes som formaldehyd eller is - kald aceton. Etter fiksering , må cellemembranen for å bli permealized for å tillate antistoffet å gå inn i cellen . Vaskemidler som Triton eller NP - 40 , eller iskald metanol kan brukes til å lage hull i cellemembranen .
Farging

Vask celler i blokkering buffer 0,5 prosent bovint serumalbumin fortynnet i fosfatbufret saltvann , BSA /PBS. Cellene inkuberes i blokkering buffer for å redusere ikke-spesifikk binding . Legg primært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer og la inkuber ved romtemperatur, for optimalisert tidsrom. Vask med blokkering buffer .
Analyse

Inkuber sekundært antistoff , som er merket med et fluorescerende tag, ved romtemperatur i 30 minutter . For å fjerne ubundet antistoff vask celler i blokkering buffer . Spinn celler i en pellet og deretter resuspender i PBS og analysere på strømningscytometer .