Hva er gelelektroforese?

Gelelektroforese er en fremgangsmåte for å separere, identifisere og karakterisere blandinger av proteiner eller nukleinsyrer. Denaturert prøver migrere etter anvendelse av elektrisitet i en tynn, våt gel vanligvis laget av polyakrylamid eller agarose. De separerte prøvene er farget slik at de kan bli sett. Gel elektroforese anvendes på protein-og nukleinsyre forskning og i sykehus for å identifisere unormale proteiner eller DNA mønstre for å diagnostisere sykdommer, genetiske defekter og genetiske forbindelser. Prøvepreparering

Når et løsemiddel slik som natrium dodecylsulfonate (SDS) tilsettes til et protein eller nukleinsyre, vil assosiere med vaskemiddel og utfolder (denaturert) proteiner og nukleinsyre. Denaturering av proteiner gjør det enklere å bestemme deres molekylvekt innen elektroforese. Mengden av prøve som kreves er vanligvis 100 til 500 ng per prøve av båndet for proteiner og 5 til 100 ng per båndet for nukleinsyrer i et totalt volum på omtrent 25 til 40 mikroliter.
Geler

En gel, vanligvis laget av polyakrylamid eller agarose, kan fremstilles eller kjøpes for å skille disse proteiner. Gelen er mye som gelatin. Det er hovedsakelig vann, men er solid nok for håndtering. Gelene inneholder buffer for å kontrollere pH. Gelen er meget tynn (1-2 mm) og rektangulære. Den ene siden ser ut som en kam med mye manglende tenner. Hullene kalles brønnene.
Sample Loading

One steder gelen i et kammer med buffer og denaturert proteiner er lagt til brønnene. Prøver av kjente molekylvekter blir tilsatt til de ytre brønner. Gels er laget med varierende mengder av polyacrylamid. En lav gelstyrke (4 prosent) er bedre for separering av molekyler med høy molekylvekt, mens en høyere gel-styrke (12 prosent) brukes for høymolekylære molekyler. En gradient gel varierer i gel styrke og som kan skille et bredt spekter av proteiner med tap av noen oppløsning.
Elektromigrasjon
p Med bruk av en høy elektrisk spenning, de denaturerte proteiner beveger seg mot bunnen av brønnen. Jo høyere vekten av protein, jo langsommere den beveger seg. Når strømmen er slått av, proteiner slutter å bevege seg. Man fjerner gel fra kammeret og det rocker i en tallerken med fargestoff. Organiske fargestoffer som Coomassie blå eller metall fargestoffer brukes til å farge proteiner mens fluorescerende fargestoffer som etidiumbromid brukes til nukleinsyrer.
Analyse av resultater
p Med den fjerning av overflødig beis, kan man se at blandinger separat i band som ser ut som stiger. Posisjonen av båndene er i forhold til avstanden beveget av standarder for å bestemme molekylvekt av prøven i hvert bånd. Gelen kan bli dehydrert med alkohol og tørket slik at den kan lagres. Fargeintensiteten av bandet da kan måles for å bestemme konsentrasjonen av protein i hvert band.
Protokoll utvikling

Standard protokoller er tilgjengelige for å jobbe med godt kjent proteiner. Hvis en forsker arbeider med en ukjent prøve, gel styrke, buffer type, kan buffer pH, spenning, kjøring, og flekken trenger alle å være optimalisert for å oppnå best mulig separasjon og signal.
Protokoller